自閉癥的生物化學連載（一）新蛋白的神秘使命

　 自閉癥(autism)，又稱孤獨癥，是一類嚴重影響青少年身心健康的精神性疾病。這種疾病在1946年由美國醫生Leo Kanner首先系統闡述，表現為社交溝通障礙、無法正常與人交流、語言發育遲緩或障礙并帶有重復刻板行為[1]。一部分自閉癥患者具備超乎常人的能力，例如機械記憶、數學、繪畫、音樂等。在諸多影視作品如《雨人》中，呆板但有超常數學天才的哥哥就是一個經典的自閉癥病人形象。這種疾病嚴重影響青少年的正常生長發育，患者常常無法進入正常的教育環境接受教育，以及因為古怪刻板行為遭受社會誤解等。

　　近年來，世界各國對自閉癥的重視程度急劇上升，醫學界不斷更新自閉癥類的診斷標準，如The Autism Diagnostic Observation Schedule (ADOS)、The Autism Diagnostic Interview-Revised (ADI-R)。遺憾的是，和諸多精神類疾病，如精神分裂、抑郁癥及雙向情感障礙等一樣，對自閉癥的診斷目前還只能依賴于臨床醫生的主觀判斷。

　　盡管已經有較確鑿的證據表明自閉癥與遺傳因素關系十分密切，遺傳學家對自閉癥數十年的研究發現，與自閉癥有關的基因多達上百個，說明自閉癥并不是單一基因致病的疾病。在對自閉癥相關基因的研究中，有幾類與自閉癥關系密切的基因及其編碼蛋白最初都是由生物化學家首先發現的，這些生物化學家進而從生物化學逐漸過渡到神經生物學研究領域，為自閉癥的神經生物學研究做出了重要貢獻。

　　在本連載中，筆者將嘗試用通俗的筆法描述這些生物化學家發現自閉癥相關蛋白質的過程，并且對這些自閉癥相關蛋白質的最新研究進展做簡略的綜述。此連載將包括以下內容：甲基化DNA結合蛋白MECP2[methyl CpG binding protein 2 (Rett syndrome)]的神秘使命、突觸粘聯蛋白neuroligin-neurexin家族走向自閉癥研究前沿、泛肽化關鍵蛋白UBE3A(ubiquitin protein ligase E3A)

　　與天使綜合征(Angelman syndrome)和自閉癥，以及用果蠅(Drosophila)模式生物研究neuroligin-neurexin家族蛋白的新功能。此連載由4篇通俗綜述組成，均由國內活躍在自閉癥研究前沿的青年科研工作者撰寫，希望為自閉癥的基礎及臨床研究提供有用信息。

　　一 新蛋白的發現

　　1992年，英國愛丁堡大學研究DNA甲基化的生物化學家Adrian Bird博士發現了一個新的能與甲基化DNA相結合的蛋白質，這是他發現的第二個能與甲基化DNA結合的蛋白質，于是將其命名為methyl-CpG binding protein 2 (MeCP2)[2]【Lewis et al. 1992】。他在找到這個蛋白質的時候，發現其功能很強大，能與單個被甲基化的DNA堿基相互作用，不過他不曾想到的是大約7年以后，這個神奇的蛋白質居然會被發現與一種嚴重的遺傳病有關，而且會成為人們理解自閉癥遺傳基礎的一把重要的鑰匙。

【Adrian Bird 圖片出處：www.realscience.org.uk】

　　說起Bird博士，那可是師出名門，他在20世紀70年代末剛剛走入科學殿堂的時候，就跟著生物化學與分子生物學界家喻戶曉的Edwin Southern博士做研究。Southern？難道是？不錯，就是Southern blot（南方墨點法，又稱Southern印跡法，一種普及的分子生物學技術，功能在于經由膠體電泳分離的樣品中，含有特定序列的去氧核糖核酸片段——資料出處：維基百科，編輯注）的發明者。

　　說起Southern blot在生物學界可是無人不知無人不曉，這種用來檢測DNA的經典方法就是Bird博士的老師Southern博士于70年代發明的[3]【Southern 1975 】。Southern博士發明的DNA雜交技術以及之后在玻璃介質上原位進行DNA合成的方法都為90年代蓬勃發展的DNA芯片技術奠定了重要基礎，這些技術目前都已經成為分子生物學工作者必備的利器。Southern博士已經獲得了美國著名的Lasker獎，筆者相信Southern博士以后很有可能贏得諾貝爾獎金。

　　與功成名就的Southern博士比起來，Bird博士當時還只是毛頭小子，但他在DNA甲基化修飾領域的一系列研究卻已為人矚目。Bird博士領導的研究組找到了一系列與甲基化DNA相結合的蛋白質。DNA的CpG島可以被甲基化修飾已經早為人知，但是功能不甚了解。研究者們猜測DNA的甲基化是關閉基因表達的開關，但直到20世紀90年代初，還沒有直接證據。Bird博士領導的研究組于1997、1998年接連發表兩篇重要文章，發現MeCP2通過與組蛋白去乙?；瘡秃衔镏苯幼饔枚种苹虻谋磉_[4,5]【Nan et al.

　　1997; Nan et al. 1998】。原來如此！DNA本身的甲基化只是一個信號，真正行使抑制基因表達功能的是甲基化DNA蛋白招募來的組蛋白去乙?；瘡秃衔?histone deacetylase complex)?；騿幼游恢玫慕M蛋白被去乙?；饔煤笫谷旧w處在緊縮的狀態，從而阻礙轉錄起始復合物的靠近，進而關閉基因的表達。Bird博士的研究組在接下來的工作中發現了一系列的甲基化DNA結合蛋白，將其命名為MBD1~MBD4[6]【Hendrich 1998】。

　　關于甲基化DNA結合蛋白的分子生物學，好像已經真相大白了。沒想到真正的暴風雨在1999年才真正到來，從此之后，甲基化DNA結合蛋白MeCP2一下子成為科學研究和醫學界的熱點和寵兒，從看似平常的甲基化DNA結合蛋白一躍成為大腦中具有神秘使命的關鍵因子。

　　二 Rett綜合征——戰火中走出的女科學家

　　1975年，剛走入貝魯特美國大學(The American University of Beirut)醫學院就讀的年輕的Huda Zoghbi立志成為一名出色的女醫生，無奈黎巴嫩內戰的戰火慢慢蔓延開來。在醫學院的第一年，Zoghbi只能躲在女廁所旁邊的防空洞里面過夜。那個時候她和同伴目睹了炸彈時常落在校園里，度過了第一個學年后，她還想回去繼續學習，但是因為弟弟被彈片擊中而受傷，他父母決定送姐弟倆去美國繼續學業。Zoghbi得以在美國田納西州Meharry醫學院繼續完成醫學學位，但是獨在異鄉的日子很難熬，還好當初在大學里一起躲避炮彈的男同學一直給她寫信，這個男生在一年后也來到美國，有情人終成眷屬。

　　Zoghbi博士 圖片出處：nihrecord.od.nih.gov/

　　這段浪漫故事發生在Zoghbi博士成為科學家之前。得到醫學學位之后，Zoghbi博士成為了一名神經科醫生，她陸續接觸到很多罹患罕見遺傳病的孩子。在Zoghbi博士做住院醫生的第二年，她遇到一個奇怪的病人，這個小女孩在2歲之前過著正常的生活，但是突然之間生長發育出現了停滯，而且剛剛學會的咿呀學語也都不會了，并有癲癇樣癥狀，雙手不自主的搓動，呈現出刻板的行為，眼光也不會隨著醫生的主動引導而變化，呈現出類似自閉癥的癥狀。

　　這是Zoghbi博士第一次接觸到Rett綜合征(Rett syndrome)。這是一種罕見的遺傳疾病，大多在女孩上發現，發病率約在一萬到一萬五千分之一，因此尋找完整的家系找到致病基因非常困難。在歷經了十幾年的努力后，1999年，Zoghbi博士領導的研究組終于找到了這個嚴重發育性疾病的致病基因—MeCP2[7]【Amir 1999】！

　　因為Rett綜合征患兒的刻板行為與避免與他人眼神交流的溝通缺陷癥狀，被神經病學家歸類為自閉癥譜系障礙(Autism spectrum disorders)。因為MeCP2基因位于X染色體上，所以此基因的缺失突變對男性影響很大，往往無法出生，而攜帶突變的女性患兒可以出生，但是在發育早期(1~3歲)時就會開始發病，導致運動能力的缺失而往往只能在輪椅上度過一生，同時沒有語言能力、認知能力嚴重受損、生活完全不能自理，對病患及家庭都造成很大痛苦。

　　Rett綜合征與我們通常說的典型自閉癥還有不同，雖然伴有刻板性行為和避免目光交流等癥狀，但典型的自閉癥患者的生長發育所受影響往往不明顯。國際精神病學界在最新版的自閉癥診斷標準中不再將瑞特綜合征繼續作為自閉癥譜系障礙進行診斷。但是MeCP2這個神秘的基因究竟與自閉癥有什么關系呢？

　　Zoghbi 博士經過多年研究，在自閉癥患者人群中發現，MeCP2基因發生的拷貝數增多可以在男性中導致嚴重的自閉癥[8]【Ramocki 2009】。這個發現再一次告訴我們MeCP2基因在大腦神經發育過程中扮演著重要角色。因為MeCP2基因位于X染色體上，所以男性只攜帶一份MeCP2基因，如果發生缺失功能的突變，則不能夠出生；如果發生染色體區段重復導致的MeCP2拷貝數加倍則整體的MeCP2基因含量上升了100%，因此大腦不能承受過多MeCP2蛋白，而發生功能性的紊亂出現嚴重的自閉癥。

　　而女性攜帶兩份MeCP2基因，在機體中還有隨機的X染色體失活(X chromosome inactivation)現象，因此，如果MeCP2基因發生加倍，在機體中還會被隨機的失活一份，加倍拷貝可能因隨機失活而減小對機體的傷害。

　　總之，MeCP2基因對生物體來說，少了不行，多了也不行。過猶不及的MeCP2基因，它的編碼蛋白無非與甲基化DNA結合而已，究竟有什么重要功能，能對神經系統的發育與正常功能造成如此大的影響呢？為了解答這個問題，必須由生物化學家與分子生物學家進行詳盡的機制研究，接下來，是生物化學家們再立奇功的時候了。

　　三 生物化學家再立奇功

　　2003年的哈佛大學神經生物學系，Michael E. Greenberg博士領導的研究組一直研究在興奮的神經細胞中基因被誘導表達的分子機制。Greenberg博士因為在20世紀80年代首次發現神經遞質乙酰膽堿(acetylcholine)可以誘導極刻早期基因(immediate early gene)c-fos的快速表達而聞名遐邇[9]【Greenberg 1986】。接下來的系列研究發現一些對神經系統有重要功能的基因，例如腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的表達也是可以被神經元的去極化興奮所誘導表達的[10]【Tao 1998】。

　　陳文博士(音譯)是在Greenberg博士研究組的一名博士后，正在研究BDNF基因被神經電信號誘導表達的分子機制。那天心血來潮，她突然想起樓上實驗室有個熟識的朋友正在研究一種好玩的甲基化DNA結合蛋白，好像名字叫MeCP2，于是就跑到樓上去把MeCP2的抗體拿過來，做了一個簡單的實驗，看看MeCP2蛋白會不會結合在BDNF基因的啟動子上。

　　做個好玩的科學實驗需要理由么？需要么？不需要么？很多時候，當我們在描述許多科學發現的時候，我們需要一個rationale，所謂為什么要做這個實驗。多年后，Greenberg博士在學術報告中說起這無厘頭的第一個實驗的時候，他自己承認，這個實驗是沒有緣由的。很多重要的科學發現就是在這樣的偶然中誕生了。但是我們不可否認，重要的科學發現有時也需要天馬行空、奇思妙想的激情！

　　陳文博士的朋友在著名的分子遺傳學家Rudolf Jaenisch博士實驗室工作。Jaenisch博士是著名的表觀遺傳學家，對DNA甲基化機制有很多系統性的研究。在1999年Zoghbi博士發現MeCP2這種甲基化DNA結合蛋白的編碼基因突變是導致Rett綜合征的原因之后，Jaenisch博士實驗室就開展了關于MeCP2的研究。2001年Jaenisch博士與Bird博士同時在Nature Genetics雜志上發表了MeCP2基因敲除小鼠的報道。

　　他們發現在MeCP2基因敲除小鼠中也出現了與Rett綜合征病人類似的癥狀，例如運動能力缺損、頻發癲癇等，因此MeCP2基因敲除小鼠成為一種非常重要的研究Rett綜合征的小鼠模型[11,12]【Chen 2001, Guy 2001】Jaenisch博士領導的研究組因此擁有很多與MeCP2有關的實驗試劑，例如針對MeCP2的抗體以及MeCP2基因敲除小鼠等。

　　陳文博士閑來無事做了這個實驗以后，結果卻給了她很大的驚喜！她發現MeCP2蛋白居然與BDNF基因的啟動子有很強的相互作用，難道BDNF基因的表達是被DNA甲基化調控的么？接下來，她發現了在神經細胞中，BDNF基因的啟動子的甲基化水平是可以被神經電活動快速調控的。

　　DNA甲基化水平的變化往往非常緩慢，需要數十個小時甚至更長的時間，而在神經系統中發現的DNA甲基化水平快速變化則提示相應的DNA甲基化酶與去甲基化酶系統在神經系統中有獨特的調控機制[13,14]【Chen 2003，Martinowich 2003】。進一步研究還發現MeCP2可以調控BDNF這種重要神經營養因子的表達，于是研究者們進而提出，Rett綜合征的發病原因是否是因為BDNF的表達失調呢？這些研究為MeCP2、Rett綜合征以及自閉癥譜系障礙的機制研究提供了重要的線索。

　　四 逆轉基因決定的命運

　　在對MeCP2影響神經系統發育與功能的研究如火如荼進行的時候，罹患Rett綜合征的小女孩和她們的家長們還在無助地尋找有可能幫助她們的靈丹妙藥。無奈Rett綜合征具備一些獨特的特征，比如并不是由于神經細胞凋亡而導致的神經退行性疾病，因此研究者根據以往的經驗推測是因為MeCP2基因的突變而導致了神經系統發育過程的功能失調。神經系統的發育速度是逐漸放慢的，換句話說，等大腦逐漸成熟之后，所謂的發育過程就會停止。那么可能是在發育早期被突變的MeCP2破壞的大腦結構，是否能在大腦發育過程已經基本完成的時候被修復呢？

　　面對這無數Rett綜合征患者和她們父母無助的眼光，Bird博士領導的研究組開始了這樣一個開創性的實驗[15]【Guy 2007】。研究者首先在小鼠的MeCP2基因前面裝上了一個開關，用于關閉MeCP2基因的表達，但是這個開關可以被藥物在需要的時候打開。這個小鼠剛出生的時候MeCP2基因是被關閉的，于是開始表現出一系列的疾病表型，比如癲癇、行動困難及容易死亡等等。

　　接下來，Bird博士研究組的Guy博士開始了一系列細致的工作。首先，Guy博士一下子大劑量地加入了能打開MeCP2基因表達開關的藥物。在缺失MeCP2基因的大腦中突然打開內源性的MeCP2，導致MeCP2蛋白的快速累積，沒想到導致的結果卻是災難性的，小鼠無法承受突如其來的MeCP2蛋白，生長發育受到嚴重影響，接下來居然發生了死亡。這好像又是MeCP2蛋白過猶不及的魔咒。Guy博士于是更換方法，用小劑量的藥物一點一點地打開被關閉的MeCP2基因。在經過了數年的反復實驗，終于到了見證奇跡的時刻！

　　這些由于缺失MeCP2基因，已經表現出嚴重癥狀，步履蹣跚，眼看就要走到生命盡頭的小鼠，當它們大腦中的MeCP2基因一點一點被打開后，這些嚴重的癥狀居然都成功地得到了逆轉！這些小鼠在大腦中的MeCP2水平緩慢提升之后，一點一點地被治愈了！原來的癲癇、行動癥狀都消失了，而且大腦海馬中的神經可塑性也得到了恢復。

　　這個實驗第一次證明，已經發育成熟的大腦仍然具備很大的潛能。喪失MeCP2的大腦，發育會出現各種缺陷。但在整個機體已經成年之后，再給予缺失的關鍵蛋白，大腦中錯綜復雜的受損神經環路仍然可以恢復正常功能。這個實驗也為Rett綜合征的治療打開了一扇嶄新的大門，同時也提示，因為基因突變而導致疾病的其他自閉癥譜系障礙，也許都可以通過適量的基因治療而重新獲得健康。

　　五 結束語

　　世界各國對自閉癥譜系障礙的研究正在全面展開，遺傳學家用最先進的測序技術繼續尋找與自閉癥有關的基因，分子生物學家與生物化學家發現多年前曾經研究過的蛋白質往往在神經系統里具有重要的功能，進而投身神經生物學研究領域。同時，我們仍然期待從基礎研究到臨床研究的轉化研究可以為自閉癥研究從準確的科學診斷到最終治療貢獻力量。

　　筆者認為，對于自閉癥這樣一種復雜的神經系統疾病的研究，必須是多學科交叉合作才能取得實質性進展的，而發展歷史較長的生物化學學科在對疾病基因的研究中扮演者非常重要的角色，接下來本系列要談到的其他幾個在自閉癥中有重要功能的基因蛋白，其實最早都是被生物化學家發現的。因此筆者非常希望生物化學在自閉癥研究這樣的新興領域中老樹開新花，在二十一世紀的神經科學研究中煥發出耀眼的光芒！