自閉癥的生物化學（三）解開自閉癥謎團的鑰匙——突觸

　　黃金時代的發現

　　20世紀80年代末與90年代初，伴隨著多聚酶鏈式反應(PCR)技術的出現，分子生物學進入黃金時代。而在此之前，高效率擴增DNA序列是不可能的。PCR的出現讓基因的克隆進入井噴時期。1991年，美國哥倫比亞大學的Axel教授與Buck博士利用PCR方法發現了龐大的嗅覺受體基因家族，并于十多年后因此一起獲得諾貝爾醫學與生理學獎。1992年，在美國德克薩斯大學西南醫學研究中心，年僅36歲的Tom Sudhof博士已經擁有了自己的實驗室，成為助理教授。他是一位生物化學家，但是卻對神經科學非常感興趣，他決心用自己學到的生物化學和最新的分子生物學方法來研究復雜的大腦。怎么入手呢？

　　故事要從突觸說起。我們大腦中的主要細胞——神經元是如何相互通訊的呢？1897年英國神經生理學家Sherrington提出了“突觸”的概念。他通過當時非常有限的神經生理學知識，創造性地提出：神經元之間通過一種叫作突觸的結構來相互通訊，而并非直接連通(圖1)。至于突觸有什么特性，怎么組成，這些問題是一百多年后通過分子生物學的手段來解決的。

　　【圖1 突觸(李葉菲 圖)】

　　年輕的Sudhof博士雄心勃勃地要用生物化學的方法來解開突觸的奧秘。當時已經知道突觸是細胞膜的脂雙層結構，上面有一些神經遞質受體，但是突觸之所以能夠形成，仿佛不是神經遞質受體的作用，因為神經遞質傳導通常發生在神經元的突觸連接建立完成的時刻，那么究竟是什么信號誘導了突觸連接的形成呢？Sudhof博士認為，一定是突觸上面有一些跨膜的蛋白質，介導了前一個神經元與后一個神經元形成突觸，然后突觸傳導才能夠發生。

　　怎樣找到這些微小突觸上的跨膜蛋白呢？他們使用了一種非常巧妙的方法，借助黑寡婦毒蜘蛛的力量。毒理學家們從黑寡婦毒蜘蛛的毒液中分離出一種蛛毒素(latrotoxin)，并應用電生理學的方法知道蛛毒素可以非常強烈地誘導突觸的遞質發放而使生物體的神經末梢癱瘓，這就是毒蜘蛛致命毒液的奧秘。

　　Sudhof博士想，蛛毒素本身是一種蛋白質，它之所以能夠誘導突觸的遞質發放，是否是蛛毒素作用在了突觸上的某種蛋白質上而產生的效應呢？應用高超的生物化學技術，Sudhof博士用蛛毒素蛋白做親和層析的誘餌，在大腦樣本中純化到了很多與蛛毒素蛋白相互作用的蛋白，接著對這些肽段進行分析以后得到可能的DNA編碼序列，應用簡并探針進行PCR的擴增，從基因文庫中擴增到了一個神奇的基因，這個基因編碼的跨膜蛋白質位于神經突觸的突觸前部分，確實與突觸遞質釋放關系密切。Sudhof博士給這個蛋白起了一個很文藝的名字—Neurexin，不知后綴-xin是否是為了紀念蛛毒素的功績[1]。

　　在發現了Neurexin后，Sudhof博士越戰越勇，繼續用Neurexin作為誘餌，用生物化學的方法發現了Neurexin蛋白在突觸后的配體——neuroligin[2]。從此神經突觸最重要的粘聯蛋白家族終于揭開了神秘的面紗。這個neurexin-neuroligin家族擁有眾多的家族成員，結構復雜功能重要，引無數生物學家競折腰。

　　筆者原以為Sudhof博士會因為發現了這個神秘突觸粘聯蛋白家族而獲得諾貝爾獎，沒想到Sudhof博士卻因為另外一個重要發現“突觸前的囊泡轉運蛋白”剛剛在今年獲得了諾貝爾醫學與生理學獎。造化弄人，Sudhof博士在接到斯德哥爾摩的電話時的第一反應居然是，“你不是開玩笑吧！”享受諾貝爾獎榮光的同時，我們期待Sudhof博士會繼續20年前發現neurexin-neuroligin的傳奇。

　　突觸與自閉癥

　　在發現了neurexin-neuroligin家族之后，Sudhof博士的團隊很快發現位于突觸后結構的neuroligin蛋白與突觸后的骨架蛋白PSD95有非常強的相互作用[3]。那么neurexin與neuroligin蛋白家族究竟與突觸的形成有什么關系呢？這時在美國哥倫比亞大學的Scheiffele博士實驗室與華盛頓大學的Craig博士實驗室發表了一系列里程碑式的文章，證明neurexin與neuroligin家族確實對于突觸的形成有非常重要的作用(圖2)[4-6]。

　　【圖2 neurexin-neuroligin 在突觸中的重要功能(李葉菲 圖)】

　　在神經生物學家正在為揭開neurexin-neuroligin家族的神秘面紗如癡如醉的時候，一篇法國科學家發表在《自然- 遺傳學》上的論文一下子讓neuroligin家族成為自閉癥研究領域的焦點[7]。法國的遺傳學家們在對多個患有自閉癥的家系進行基因測序的分析中，意外地發現位于X染色體上的neuroligin3與neuroligin4基因在自閉癥病人中都發生了突變。同一個研究組于2007年又發現另外一種突觸中的重要骨架蛋白編碼基因Shank3的突變也與自閉癥緊密相關[8]。自閉癥這種復雜的神經系統疾病難道是突觸的功能發生異常而導致的么？

　　讓我們簡單聊聊自閉癥的疾病特點，Kanner醫生在1946年發表在《美國精神病學》期刊上的一篇論文，第一次描述了“自閉癥”這種疾病[9]。Kanner醫生發現有一類小朋友，具備一些獨特的行為特征：不喜歡與外界交流，通常自己玩耍，反復地做同樣的一些事情或同樣的動作，而且常常有語言障礙，無法正常表達自己的想法或者只能說一些簡單的音節與詞語。

　　因此我們可以將自閉癥的癥狀歸為3個重要方面：交流溝通缺陷、重復刻板行為與語言發育缺陷。自閉癥的癥狀有輕重之分，嚴重的自閉癥病人完全無法與人交流，而且往往因為無法經過足夠的教育得到改善而很難融入到社會中去。在意外死亡的自閉癥病人的大腦中進行的解剖研究也沒有發現自閉癥病人的大腦中有任何病變，既不像阿爾茲海默病人中有淀粉樣沉積和病變，也不像帕金森病人那樣缺失某一類神經元比如多巴胺能神經元，等等。

　　因此，對于自閉癥的研究在分子生物學和分子遺傳學興起之前，一直停留在假說與猜想階段，有些科學家認為自閉癥與遺傳因素有關，因為雙生子中一個出現自閉癥，另外一個出現自閉癥的幾率大大增加。但是還有一些科學家認為自閉癥完全是后天的外界因素導致的，甚至與孕期的過敏或母親的免疫失調有關。必須指出的是，這些猜想都沒有足夠的實驗證據加以支持。而20世紀90年代分子生物學手段的興起，加上人類基因組計劃的開展，使得對疾病的基因突變研究大大加快。

　　經過對大量自閉癥病人的遺傳篩選，科學家們已經可以基本確認自閉癥與遺傳因素關系最為密切，有一系列重要基因被發現在自閉癥病人中發生了突變，例如neuroligin、neurexin、shank3等等，而很多在自閉癥病人中發生了突變的基因，都是與突觸功能密切相關的。因此，對于自閉癥的神經生物學研究，必須緊緊圍繞著突觸展開。因此，當我們回頭看為什么自閉癥病人大腦中沒有出現明顯的病變的時候，也就會明白，與老年癡呆癥或帕金森癥此類由神經元的病變、死亡導致的疾病不同，自閉癥是一種神經突觸功能異常導致的疾病。當我們明白了這點之后，就可能對這些異常來針對性地設計藥物，對自閉癥進行針對性的治療。

　　自閉癥的動物模型研究

　　通過對自閉癥進行近十年的遺傳學研究，遺傳學家發現自閉癥并非單一基因致病，有很多基因都被發現在自閉癥病人的基因組中發生了突變，但是并沒有一種或幾種基因占主導地位(圖3)?？茖W家們于是想，這些在自閉癥病人中發生了突變的幾十種甚至上百種基因，它們之間是否有內在的聯系呢？經過生物信息學的分析，科學家們已經陸續發現了自閉癥致病基因之間確實有一些內在聯系，從而解釋了為什么不同的基因突變會導致同一種疾病[10]。

　　【圖3 自閉癥病人遺傳因素圖(李葉菲 圖)】

　　但是，一個非常重要的問題還沒有回答，這些在自閉癥病人中發現突變的基因，它們是否真的是導致自閉癥的罪魁禍首呢？雖然這些基因突變導致重要蛋白質的結構與功能改變，但是因為它們大多出現散發的狀態，就是說一個自閉癥病人基因組中找到的突變往往極少可能會在另外一個自閉癥病人的基因組里找到。因此，從統計學及遺傳學上，我們無法知道這些基因突變究竟是否致病，我們需要利用生物學的方法來予以確認。

　　2007年，已經功成名就，成為美國國家科學院院士的Sudhof博士又做了一個重要的工作——利用現代神經生物學的手段證明了neuroligin家族之一的neuroligin3基因突變確實是導致自閉癥的原因[11]。

　　遺傳學家在對自閉癥病人的遺傳篩選中發現了neuroligin家族之一的neuroligin3基因在一些自閉癥病人的基因組中會發生突變，這個突變僅僅會改變一個氨基酸，將451的精氨酸變成了半胱氨酸(R451C)。那么被點突變改變的neuroligin3基因編碼的蛋白會不會是導致自閉癥的罪魁禍首呢？Sudhof博士的團隊做了一系列精湛的工作，利用小鼠遺傳學的方法， 將小鼠基因組上面的neuroligin3基因也做了對應的突變。于是這個小鼠就攜帶與人類同樣的R451C突變。攜帶這個突變基因的小鼠，是否會像人類自閉癥病人一樣出現這些類似人類疾病的異常呢？科學家們用一些行為學研究方法，對這些攜帶突變的小鼠與正常小鼠進行比較，例如，將小鼠置于一個可以自由運動的三廂，將被實驗鼠置于中間，左廂放著一個玩具，右廂放一個同伴小鼠。

　　正常的小鼠通常會表現出更喜歡與同伴小鼠待在一起打打鬧鬧，而非與玩具玩耍，但是攜帶了neuroligin3 R451C突變的小鼠則沒有對同伴小鼠表現出更多的興趣，表現出對同伴與玩具“一視同仁”。這表示攜帶突變的小鼠沒有像正常小鼠一樣的社會交往行為?？茖W家們繼續在突變小鼠的神經元中發現了異常，他們發現這種neuroligin3 R451C突變非常特異性地影響了神經元之間的抑制性突觸連接，而造成神經元網絡發生功能紊亂。這個里程碑式的工作除了證明突觸異常很有可能是導致自閉癥的原因以外，還指明了針對相應的突觸異常來設計藥物來治療自閉癥的新方向。

　　自閉癥的科學研究：昨天、今天和明天

　　自閉癥是一種非常復雜的疾病，是人類社會的巨大挑戰。迄今為止，還沒有哪種疾病影響如此之廣，而又難找出病因。自閉癥與神經系統功能的密切相關也常常令人浮想聯翩，我們的社會交往行為、性格、個性，甚至思想等等，是否，或者在多大程度上由我們的基因決定？

　　以前對于自閉癥的研究僅僅只能局限于假說與理論推導，現代生物學的發展已經可以讓我們進行大規模的基因組測序來找到可能的致病基因致病突變，然后利用現代生物學的手段研究發生了突變的基因怎樣影響神經系統的功能，甚至按照人類的突變去制造動物模型來研究基因突變致病機制，同時，也推動了治療方法平臺的創立。今后，對于復雜疾病的研究必將涉及多種生物學、醫學及工程學手段。研究每一種復雜疾病的同時也為人類了解自身提供了一把難得的鑰匙。尤其是對自閉癥這種神秘疾病的探索，面對著一無所知的黑暗地帶，我們不能瞻前顧后而應不為未知所懼，奮勇前進，在攻克一個又一個未知的科學堡壘的同時造福大眾，為促進大眾健康盡到自己的一份力量。